高效液相色譜-柱后光化學衍生法測定油茶中黃曲霉毒素的方法研究

目的建立高效液相色譜-柱后光化學衍生法測定油茶中黃曲霉毒素含量的方法。方法市售油茶油樣品,經80%甲醇水溶液提取、離心,吸取上清液稀釋,專用免疫親和柱凈化后,采用高效液相色譜儀帶熒光檢測器串聯柱后光化學衍生器測定黃曲霉毒素。同時,對樣品提取條件的選擇、樣品凈化過程、流動性比例選擇等進行優化實驗研究。結果黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范圍內線性關系良好,相關系數r²＞0.9999,在0.5μg/kg（檢出限）、10μg/kg（*）添加水平下的回收率為88.4%～104.5%,相對標準偏差0.3%～6%。結論該方法簡單、準確、重現性好,適用于油茶中黃曲霉毒素的定量分析。

黃曲霉毒素是迄今發現的毒性最大的真菌毒素，是科學界普遍認同的3大強致癌物質之一。黃曲霉毒素主要污染糧油制品，易在玉米、稻谷、花生、桃仁、果仁、堅果等油脂含量較高的糧食作物上生長。我國國家標準GB 2761—2017規定食用油中黃曲霉毒素B1的*不得高于10μg/kg。目前針對植物油中黃曲霉毒素的檢測主要依據食品中黃曲霉毒素的檢測方法如：高效液相色譜法、同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、酶聯免疫法，茶油中黃曲霉的檢測相關文件少之又少。本研究基于HPLC-柱后光衍生的基礎上結合免疫親和濃縮富集，建立一種準確、高效的測定和確證茶油中黃曲霉毒素的方法。

1 實驗部分

1.1 試驗材料

尚野山茶油（油茶籽油-安徽尚野茶油有限公司）；純正茶油（油茶籽油-浙江久晟茶油科技股份有限公司）

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜法-帶熒光檢測器（島津）；光化學柱后衍生器（Pribolab® KRC光化學柱后衍生器）；超聲波清洗裝置；渦旋儀；分析天平；固相萃取裝置（
Pribolab® 8位泵流操作架）；黃曲霉毒素免疫親和柱（PriboFast®黃曲霉毒素總量免疫親和柱3ml）。

甲醇（色譜純）；Pribolab® PBS緩沖液；高純水；黃曲霉毒素標準品（Pribolab®25µg/mL黃曲霉毒素(Aflatoxin)B1,G1,B2,G2/甲醇）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試樣處理 準確稱取5.00g油樣于 50mL 離心管中，加1.0g氯化鈉；加 25mL70%甲醇水，渦旋混勻，置于超聲波或渦旋振蕩器中振蕩 30min ；過玻纖濾紙，取5mL濾液，加20mL PBS溶液稀釋混勻，備用。冷藏條件下儲存的黃曲霉毒素免疫親和柱取出后恢復至室溫，移取上述提取液全部重力過柱，分別用10mL PBS和10mL一級水加壓清洗，棄去全部流出液，并使 2~3mL 空氣通過柱體；以2.0mL 色譜級甲醇分兩步進行洗脫，重力洗脫。最后輕微加壓排凈洗脫液，0.22μm 濾膜過濾，待測。

1.3.2 分析條件 色譜柱：PRIBOLAB ODS C18液相色譜柱（5μm，4.6mm×150mm）；流動相：甲醇：水=45：55，等度洗脫；流速1mL/min；進樣量：20μL；激發波長:360nm；發射波長:440nm。

2 結果與結論

2.1樣品前處理

比較甲醇、乙腈、正己烷后，得出70%甲醇水提取效果較好，溶劑中油脂含量明顯較低，回收率可達85%以上；由于茶葉基質復雜，在過柱凈化時，使用0.5%吐溫-PBS稀釋后上樣，可有效減少色素等雜質在柱體上的吸附，上樣完畢后，繼續用PBS溶液進行淋洗，淋洗體積可視樣品情況而定，一般需要10mL。如果排出的淋洗液中還有顏色，可適當增加淋洗液體積。最后用水再淋洗，以減少表面活性劑對儀器的不良影響。

2.2 儀器條件

流動相選擇甲醇：水=45：55，使用150mm的C18色譜柱，可以在20分鐘出AFTG2、G1、B2、B1四個峰，串聯Pribolab® KRC光化學柱后衍生器增強AFTG1、B1的熒光強度，響應高，峰型好。

2.3 工作曲線和最小檢出限

準確吸取40μL 25μg/mL的黃曲霉毒素標準溶液，用甲醇定容至1mL，制得1μg/mL的儲備液，逐級稀釋成0.5,1,5,10,50μg/L的標準系列溶液，按濃度由低到高的順序進樣，選定的色譜條件下測定，橫坐標為濃度，縱坐標為峰面積，進行線性回歸計算。結果表明黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.5～50 ng/mL范圍內線性關系良好,相關系數r²＞0.9999。計算3倍信噪比時所對應的樣品濃度，得到的方法檢出限為0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg。

黃曲霉毒素G2 G1 B2 B1標準曲線、回歸方程、相關系數

1μg/L 與 茶油樣品0.5μg/L添加的液相譜圖

2.4 精確度與回收率

兩種茶油樣品，分別做了0.5μg/kg（檢出限）、10μg/kg（*）的添加，10μg/kg的樣品都做了平行實驗。方法的回收率為88.4%～104.5%,相對標準偏差為0.3%～6%。

兩種茶油樣品液相檢測峰面積、濃度、回收率數據匯總

3 結論

此所建立的高效液相色譜-柱后光化學衍生法測定油茶中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法，用甲醇水提取茶油中的黃曲霉毒素，經PriboFast®黃曲霉毒素總量免疫親和柱凈化和富集，在高效液相色譜串聯Pribolab® KRC光化學柱后衍生器檢測下，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限可達0.05μg/kg、0.03μg/kg、0.1μg/kg、0.04μg/kg，滿足《GB2761-2017-真菌毒素*》要求。